CRISPR技術：剪切拼接基因序列的“魔法剪刀”
Tania Louis
生物學博士、《瞰創新》撰稿人
CRISPR/Cas9技術作爲一種基因編輯手段，具有巨大潛力，可以精准地編輯生物基因組。其原理基于細菌的天然免疫系統，通過指導蛋白(Cas)和RNA的配合來精確修飾DNA序列。這種技術不僅在基礎科學研究中廣泛應用，還在醫療、農業和生物生産等領域展現出巨大應用前景。CRISPR/Cas9技術在醫學和農業領域的應用前景如何？它能否真正實現治療基因相關疾病和改良農作物的目標？CRISPR/Cas9技術的局限性和風險是什麽？如何解決其可能引發的倫理和法律問題？
CRISPR 是在許多原核生物的基因組中都存在的一種DNA 序列，是細菌抵禦病毒入侵的一種防禦手段。科學家們受啓發，開發出了CRISPR基因編輯技術。
CRISPR/Cas系統通過切割基因、插入新基因，能夠快速、精確地修改目標生物的遺傳信息。
CRISPR的應用範圍很廣泛：基因治療、醫療保健、農業、生物生産等。
CRIPSR/Cas引發了許多倫理問題，對于其潛在用途和影響衆說紛纭，也在歐洲議會上引發了辯論。
隨著去年歐洲議會放寬對轉基因技術的限制[1]，一種叫做CRISPR/Cas9的基因編輯技術開始引發爭議：一些人對它深表擔憂，另一些人則抱樂觀態度。本文將介紹CRISPR/Cas9的原理，以及這種技術蘊含的可能性、局限性和潛在挑戰。
01
CRISPR/Cas9，基礎科研的諾獎成果
CRISPR（成簇的規律間隔的短回文重複序列）是在許多原核生物（細菌、古細菌等）的基因組中都存在的一種DNA 序列，1987 年首次在大腸杆菌中發現[2]。在CRISPR序列中，有多個較短的重複序列，由間隔序列分隔開。經過 20 多年[3]的深入研究，學術界發現原來CRISPR系統是細菌抵禦病毒入侵的一種防禦手段[4]。
間隔序列其實是來自病毒的基因片段，由細菌主動整合到自己的基因組中。當病毒入侵，CRISPR DNA 會被轉錄成 RNA，RNA 又被切割成crRNA (CRISPR RNA)，作爲引導分子。每個crRNA對應一個間隔序列，也就是說對應一種病毒。成熟的 crRNA與Cas 蛋白形成核糖核蛋白複合體，crRNA 引導 Cas蛋白定位病毒核酸，進行切割，達到免疫防禦的目的，從而結束感染。
圖片來源：PI France
因此，CRISPR/Cas抵禦外來病毒入侵分三個步驟：1、crRNA的表達；2、crRNA識別病毒基因組；3、crRNA 引導 Cas 蛋白靶向切割病毒核酸。當原核生物遇到新病毒時，會將其的基因片段添加到自身的CRISPR記憶庫中，因此 CRISPR/Cas免疫反應具有特異性（只針對一種病原體）。更重要的是，記憶庫就存在于細菌的基因組中，可以“代代相傳”。作爲一種基因編輯手段，CRISPR系統操作簡便，在微生物學界之外也廣爲人知。
02
使用 CRISPR/Cas9 修改基因組
CRISPR/Cas系統的基本原理，是將crRNA與Cas酶結合。crRNA負責將Cas酶帶到某種生物基因序列中的目標位置，Cas酶充當“分子剪刀”，在特定位置切割 DNA。切割後，有幾種可能性。其一，生物體自身存DNA損傷修複的應答機制，會將斷裂上下遊兩端的序列連接起來，從而實現了細胞中目標基因的敲除。其二，如果給細胞提供同源修複模板，模板就會被插入到切口裏。
由于CRISPR/Cas9系統能在DNA 序列的任意位置進行切割，故適用于遺傳信息的精准編輯——引入小小的基因突變、插入新基因、關閉某個基因的功能（即不給細胞提供同源修複模板）。現在，訂購定制的crRNA簡單又便宜，CRISPR已成爲了一種有效易得的基因編輯技術。
“由于CRISPR/Cas9系統能在DNA 序列的任意位置進行切割，故適用于遺傳信息的精准編輯。”
在原核生物中，Cas酶種類繁多，具有不同的功能和特性[5]。首個CRISPR系統使用的是Cas9，它可以對雙鏈 DNA進行切割。然而，不同微生物産生的Cas酶，功能略有差異，剪切精度、剪切片段長度不盡相同。Cas12可以一次性編輯多個基因片段、進行表觀遺傳操控，也可用于病原體DNA檢測。Cas13能切割RNA，故可用于檢測病原體RNA，還能用于編輯tRNA，在不改變DNA的前提下影響基因的表達。
CRISPR/Cas基因編輯技術蓬勃發展，衆多課題組正在這一領域開展研究。2012年，法國和美國科學家Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer Doudna將首創的CRISPR/Cas9基因編輯技術在論文中公布與衆[6]，于2020年榮獲諾貝爾化學獎[7]。同期，其他的學者發表了使用CRISPR/Cas9編輯真核細胞基因組的初步結果，包括美籍華裔科學家張鋒，及其合作者[8]、前導師 George Church [9]。這四位科學家後續都創辦了基因編輯生物技術公司，而由于CRISPR/Cas 技術具有重大的經濟價值，四人所屬的院校已經打起了專利戰。
03
CRISPR/Cas技術的應用
CRISPR/Cas 技術僅僅誕生了十年，卻已成爲生物學基礎研究的實驗室“標配”。由于能方便快捷地替換、修改基因，CRISPR/Cas很適合用于研究特定基因的功能。即使須要在整個基因組裏篩查某些特定基因也不在話下。CRISPR的應用領域相當廣泛，尤其在醫療、農業學和生物生産三個領域。
治療單個基因功能障礙引起的疾病，CRISPR/Cas能大顯身手。CRISPR/Cas9系統可作爲一種新型基因療法，把突變致病基因替換成功能正常的健康基因。2023年底，英國成爲了第一個批准CRISPR/Cas治療遺傳疾病的國家。Vertex和CRISPR Therapeutics兩家歐美企業聯合開發的CRISPR/Cas療法CASGEVY能治療血紅蛋白基因突變引起的慢性貧血，已在美國和英國獲批。在法國，這種療法于2024年1月18日獲批提前准入[10]。
對于因少數基因異常導致的疾病，CRISPR/Cas簡化了治療，但它無法克服基因療法的所有局限性。血液、眼睛、肝髒等器官易于CRISPR/Cas系統送達，但在不引起副作用的前提下，精准針對所有病變細胞仍是個挑戰。CRISPR/Cas的潛在醫學應用不限于基因治療和診斷，還包括消滅艾滋病感染者體內的病毒[11]、對抗瘧疾[12]、輔助器官移植[13]、治療糖尿病[14]等，以上用途目前處于測試階段。
圖片來源: PI France
從古至今，農業和畜牧業一直在通過漫長的人工選擇和雜交育種，篩選動植物的優良性狀，這也是一種“基因修改”。分子生物學的發展徹底顛覆了傳統模式。現在我們能更清楚地了解每個基因的作用，精准編輯，甚至插入新的基因，而不是在新一代動植物出生後再碰運氣尋找突變，大大提高了效率。潛在的應用簡直是無窮無盡：培育耐熱、耐旱、抗病蟲害特質（減少農藥使用）；提高産量（減少化肥使用）；延長農作物存放期限以避免浪費；增加營養物質含量[15]等等…
CRISPR/Cas 實現的定向基因修改也可用于培育新型農産品，例如天然無咖啡因的咖啡豆[16]、無過敏原的作物。現在就有人在研發無麸質小麥[17]。如果不是刪除基因而是插入新基因，就能將酵母、藻類或細菌等微生物變成“生物工廠”，合成生物燃料、藥用化合物、化妝品原料、維生素等。簡單易用、潛力無窮的CRISPR/Cas已經在合成生物學引發了一場技術革命。
04
CRISPR/Cas的局限性
CRISPR/Cas有時被描述得無所不能，但它也有局限性。即使精准編輯了一個生物的基因組，也不能保證表現型一定會改變。有些生理機制由多個基因控制，就算使用CRISPR/Cas，也無法輕易操控。基因對生物體的正常功能至關重要，對其進行修改可能會産生有害的後果。功能已知的基因，不能直接移植給別的物種，指望其擁有相關特性。在受控環境中用簡化模型開展的實驗，得到的結果未必能直接應用于實際。
更重要的是，CRISPR/Cas並非100%可靠，可能會出現脫靶現象，修改不該修改的基因序列。如果基因療法期間發生脫靶，會有不利後果。除此之外，還有其他的技術挑戰有待克服[18]。CRISPR/Cas療法的可獲性也是個問題。CASGEVY標價220萬美元，就算能治愈疾病，價格仍太高，勢必難以普及。
“雖然CRISPR/Cas的一些用途看似美好，但另外的一些用途會引發倫理道德困境。”
價格只是CRISPR/Cas技術引發的諸多社會倫理問題之一。就像任何技術一樣，CRISPR/Cas本身沒有好壞之分，一切由使用方式決定，包括短期內可實現的用途，以及未來有可能實現的用途。通過編輯基因治好不治之症，固然美好，但基因編輯可不是兒戲。2018年，南方科技大學原副教授賀建奎違法進行人類胚胎基因編輯活動，對若幹個人類胚胎基因進行修改，試圖使其天然具備艾滋病抵抗力。成果宣布後，賀建奎受到了學界的強烈譴責，以及法律的制裁，被判處有期徒刑三年，2022年刑滿釋放。雖然賀建奎的實驗采取了違規手段，且違背倫理道德，但最後的確有兩名基因編輯嬰兒降生[19]。
倫理困境還有很多：該不該對植物進行基因改造，以提高其抗旱能力？該不該改造寵物貓，使其毛發不容易引發人類過敏[20]？蚊子傳播的疾病每年導致數十萬人死亡，該不該通過基因編輯大規模消滅蚊子種群[21]？如果你對三個問題的答案不同，原因是什麽？
這些都是複雜的問題，但考慮到技術發展的速度之快，形成共識勢在必行。歐盟的“六國集團”彙集了六大歐洲研究機構，包括法國國家科學研究中心（CNRS）。在歐洲議會最近的辯論中，CNRS發布新聞稿呼籲“應重視轉基因生物性狀引發的風險，而非轉基因技術本身的風險。”[22] 未來會形成怎樣的新法律法規呢？我們拭目以待。
作者
Tania Louis
編輯
Meister Xia
1. https://www.europarl.europa.eu/news/fr/press-room/20240202IPR17320/nouvelles-techniques-genomiques-et-transition-ecologique-des-agriculteurs
2. https://journals.asm.org/doi/10.1128/jb.169.12.5429–5433.1987
3. https://link.springer.com/article/10.1134/S0006297922080090
4. https://www.science.org/doi/10.1126/science.1138140
5. https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-022–00567‑0 Detailed, sourced overview of the function and potential applications of various Cas proteins
6. https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2020/press-release/
7. https://www.science.org/doi/10.1126/science.1225829
8. https://www.science.org/doi/10.1126/science.1231143
9. https://www.science.org/doi/10.1126/science.1232033
10. https://www.has-sante.fr/jcms/p_3490709/fr/casgevy-exagamglogene-autotemcel
11. https://clinicaltrials.gov/study/NCT05144386
12. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1567134823000175
13. https://www.frontiersin.org/journals/immunology/articles/10.3389/fimmu.2023.1295523/full
14. https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(17)30274–6
15. https://innovativegenomics.org/crisprpedia/crispr-in-agriculture/
16. https://link.springer.com/article/10.1007/s10068-022–01082‑3
17. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12837
18. https://www.frontiersin.org/journals/oncology/articles/10.3389/fonc.2020.01387/full
19. https://www.technologyreview.com/2019/12/03/131752/chinas-crispr-babies-read-exclusive-excerpts-he-jiankui-paper/
20. https://www.jacionline.org/article/S0091-6749(19)32107–4/fulltext
21. https://www.nature.com/articles/s41467-021–24790‑6
22. https://www.leibniz-gemeinschaft.de/fileadmin/user_upload/Bilder_und_Downloads/%C3%9Cber_uns/Europa/G6_In-depth_statement_NGT.pdf
